草甸退化指示植物黄帚橐吾的质体基因组特征

李小娟^1,2秦丽莹¹韩龙¹何宝平¹邓因子¹杨鑫光^1,2*

（1.青海民族大学生态环境与资源学院，西宁810007；2.青海省特色经济植物高值化利用重点实验室，西宁810007）

摘要：黄帚橐吾是青藏高原高寒草甸生态系统广泛分布的毒杂草。在过度放牧的干扰下，黄帚橐吾功能性状适应作用还不清楚。为了解黄帚橐吾叶绿体基因组特征，本研究分析了其叶绿体基因组结构和基因构成特征，并进行系统演化基因组分析。结果表明：（1）黄帚橐吾叶绿体基因组的功能基因有134个，其中包括8个rRNA基因、37个tRNA基因和89个蛋白编码基因。（2）在黄帚橐吾叶绿体基因组的密码子组成中，RSCU值>1的密码子有30个，其中以A/U碱基结尾的有27个；RSCU值<1的密码子有32个，其中以G/C碱基结尾的密码子偏多，为29个。（3）在黄帚橐吾的叶绿体基因组中，检测出37个散在重复序列，包括17个正向重复序列和18个回文重复序列；检测到42个SSR位点。（4）通过最大简约法（MP）对黄帚橐吾及其近缘类群共计12个物种质体基因组构建系统发育树，结果显示黄帚橐吾可能是橐吾属中比较古老的物种。从而在分子层面更多地认识黄帚橐吾的遗传背景和种质资源鉴定，为环境适应性分析提供理论支持。

关键词：黄帚橐吾；质体基因组；指示植物；重复序列；系统发育分析

中图分类号：Q943.2  文献标识码：A

文章编号：1005-9393(2022)03-0064-10

作者简介：李小娟（1970-），女，理学硕士，副教授，主要从事青藏高原草地生态学研究。E-mail:chouerli@126.com。*通讯作者：杨鑫光（1979-），男，农学博士，主要从事植物生理生态、退化草地恢复研究。E-mail:yangxg618@163.com。

基金项目：青海省科技厅自然科学基金项目（项目编号：2019-ZJ-7073）；青海省财政支农资金林业新技术推广项目（项目编号：2021-002）。

黄帚橐吾（Ligularia virgaurea）是青藏高原东缘高寒草甸典型游击型克隆植物。无论营养生长期，还是有性繁殖期，均可通过地下横走的根状茎进行克隆生长^[1]。目前青海省橐吾属草地植物危害面积已达19.4×10⁴hm^2[2]。因其体内含有有毒的白色乳液和难闻气味，牛羊误食之后会致死^[3]，由于牲畜的选择采食和过度放牧，黄帚橐吾已经成为退化草甸的优势毒杂草。当草甸上出现庞大的黄帚橐吾种群，往往预示着该地区的草甸开始出现或已经处在退化状态^[4]。

质体有自身完整的一套遗传系统，即质体基因组，包括叶绿体在内的质体细胞器执行其功能在一定程度上都依赖这套遗传系统^[5]。质体基因组由于自身的保守性，且存在一些多态性变化而被广泛用于物种起源与分类研究^[6-12]，此外，质体基因组还有望成为植物鉴定的超级DNA条形码^[13]，为植物亲缘物种的系统发育研究以及种间鉴别等方面提供巨大便利^[14,15]。本研究拟解析黄帚橐吾的质体基因组特征，以更多了解该物种遗传信息，为系统演化和种质资源鉴定奠定理论基础，同时为黄帚橐吾的环境适应性分析和资源合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 获取叶绿体基因组数据

从NCBI数据库下载黄帚橐吾与已公布的8种其他橐吾属植物以及随机挑选3种千里光属（Senecio）植物的叶绿体基因组序列各一条。所涉及物种有黄帚橐吾（Ligularia virgaurea，MN783367.1）、复序橐吾（Ligularia jaluensis，MF539931.1）、窄头橐吾（Ligularia stenocephala，MT985379.1）、无缨橐吾（Ligularia biceps，OK448480.1）、蹄叶橐吾（Ligularia fischeri，KT988070.1）、狭苞橐吾（Ligularia intermedia，MF539930.1）、全缘橐吾（Ligularia mongolica，MF539932.1）、离舌橐吾（Ligularia veitchiana，MF539933.1）、鹿蹄橐吾（Ligularia hodgsonii，MF539929.1）以及糙叶千里光（Senecio asperifolius，MW770460.1）、莫尔千里光（Senecio moorei，MH483950.1）和产自肯尼亚山区的物种Senecio schweinfurthii（MH483950.1）。

1.2 叶绿体基因组注释、基因组图谱绘制

叶绿体基因组注释主要是指tRNA（transfer RNA）基因的注释、rRNA（ribosomal RNA）基因的注释以及蛋白编码基因的注释^[16]。本研究对已获得的黄帚橐吾叶绿体基因组完整序列利用在线软件GeSeq进行基因注释^[17]，经过手工校正后得到最终的叶绿体基因组基因注释结果。将最终得到的基因组注释信息与已公布的信息比较，再利用在线软件OGDRAW进行叶绿体基因组图谱的绘制^[18]。

1.3 密码子偏好性分析

密码子存在简并性，每个氨基酸往往被多个同义密码子所编码。不同的物种、不同的生物体的基因组密码子使用情况皆不相同，除了受自然选择和基因突变等作用的影响以外，也与环境适应性和物种进化有关^[19]。RSCU值以1为限，若RSCU值小于1，表明该密码子不经常使用；若RSCU值大于1，表明该密码子使用频繁；若RSCU值等于1，则表明无密码子偏好性。本研究利用CodonW（version 1.4.2,http://codonw.sourceforge.net/）软件分析黄帚橐吾叶绿体基因组密码子偏好情况。

1.4 重复序列分析

叶绿体基因组的重复序列有散在重复和串联重复两种形式，散在重复序列一般在基因组中呈分散式分布，包括正向重复（F型）、反向重复（R型）、回文重复（P型）以及互补重复（C型）四种类型。重复序列有助于促进叶绿体基因组重排，增加种群遗传多样性^[20-22]。本研究借助REPuter在线工具鉴定散在重复序列^[23]，其参数设置为：最小长度设为30bp，海明距离（hammingdistance）设为3，鉴定F、R、P和C四种类型。

简单重复序列（SSR）是一类由几个核苷酸为重复单位而组成的串联重复序列，长度达到了几十个核苷酸，叶绿体基因组上的SSR标记称之为cpSSR标记。本研究使用MISA-web在线软件（http://misaweb.ipk-gatersleben.de/）检测cpSSR^[24]，参数设置为1-10（单碱基重复10次及以上），而2-6、3-5、4-4、5-3、6-3中当相邻的SSR位点相距不足100bp时，将其合并为复合型SSR。

1.5 IR边界分析

选取包括黄帚橐吾在内的已知质体基因组完整序列的橐吾属植物，使用在线软件IRscope（https://irscope.shinyapps.io/irapp/）对反向重复区和单拷贝的边界进行分析^[25]，参数设置取默认值。

1.6 系统发育分析

选取所有已知的9个橐吾属植物和3个千里光属植物的叶绿体基因组完整序列，利用MAFFT在线软件将其对齐^[26]，使用软件MEGA通过最大简约法（Maximum parsimony，MP）构建系统发育树^[27]，bootstrap设为1000，其他参数取默认值，千里光属为外类群构建橐吾属的系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 叶绿体基因组结构特征

黄帚橐吾的完整叶绿体基因组为四段式环状DNA分子，具有1个小单拷贝区（SSC）、1个大单拷贝区（LSC）和2个反向重复区（IR）（图1）。注释得到功能基因有134个，其中包括8个rRNA基因、37个tRNA基因和89个蛋白编码基因。该基因组上的基因类别见表1，各基因在叶绿体基因组上的相对位置如图1所示。

表1 黄帚橐吾叶绿体基因组基因分类

Table1 Genetic classification of chloroplast genome of Ligularia virgaurea

图1 黄帚橐吾叶绿体基因组图谱

Figure1 Genome map of Ligularia virgaurea chloroplast

注：圈内侧的是反向编码的基因，圈外侧的是正向编码的基因。内部灰色圈代表GC含量。

2.2 密码子偏好性分析

黄帚橐吾叶绿体基因组上共有26316个密码子。对各密码子种类的总体使用性检测结果表明：RSCU值>1的密码子有30种，其中以A/U碱基结尾的有27种；RSCU值<1的密码子有32个，其中以G/C碱基结尾的有29个，说明在黄帚橐吾叶绿体基因组中的密码子更倾向以G/C碱基结尾；色氨酸（Trp）的RSCU值为1，无密码子偏向性（表2）。

表2 黄帚橐吾叶绿体基因组密码子使用率

Table2 Codon utilization ratein Chloroplast genome of Ligularia virgaurea

2.3 重复序列特征

使用REPuter程序在黄帚橐吾叶绿体基因组中共检测到37个散在重复序列，只包括正向重复序列（F型）和回文重复序列（P型）两种类型，并无反向重复（R型）和互补重复（C型）类型（表3）。其中，正向重复序列18个，回文重复序列19个。长度为30bp的重复序列中包括6个正向重复和7个回文重复，长度为31bp的重复序列中有5个正向重复和5个回文重复，分布数量相对较多。正向重复中最长的为41bp；回文重复中最长的为24830bp，这正是叶绿体的IR区。

表3 黄帚橐吾叶绿体基因组中的散在重复序列

Table3 Scattered repeats in the chloroplast genome of Ligularia virgaurea 

使用MISA-web软件在黄帚橐吾的质体基因上共检测到42个SSR位点，其中复合型SSR位点两个、纯净型SSR位点40个（表4）。这些SSR序列主要为单碱基重复，共计40个（复合型SSR拆分成纯净性之后计算）；二碱基重复的有3个，重复次数均为6；五碱基重复的只有1个，重复次数为3；未发现三碱基重复、四碱基重复和六碱基重复的类型（表4，图2）。

 表4 黄帚橐吾质体基因组上的SSR位点类型及数量

Table4 Type and numbers of SSR location in the plasmids genome of Ligularia virgaurea

图2 黄帚橐吾叶绿体SSR的基序与数量

Figure2 Motifs and number of SSR in plastid genome of Ligularia virgaurea

注：纵坐标为SSR位点数量，横坐标为SSR的基序重复次数。

2.4 橐吾属的IR边界特点

从NCBI下载所选取的9个物种的叶绿体基因组序列（fasta格式），运用在线软件IRSCOPE在网站（https://irscope．shinyapps．io/irapp/）进行处理后绘制成图。质体基因组通常为环形结构，IRs与LSC和SSC存在4个边界，即JLB（LSC-IRb）、JSB（IRb-SSC）、JSA（SSC-IRa）和JLA（IRa-LSC）（图3）。结果显示橐吾属各物种的边界高度保守，无明显的扩张或收缩，橐吾属各物种的4个边界所处的基因位置高度趋同：JLB位于rps19和rpl2之间；JSB位于ycf1和ndhF基因之间；JSA位于ycf1基因上；JLA紧邻trnH基因。

图3 橐吾属9种植物的边界序列差异分析

Figure3 The comparison of sequence divergence of boundary region among selected nine species of Ligularia

2.5 系统发育分析

基于质体基因组完整序列的最大简约法的系统发育树显示，橐吾属聚为一支，黄帚橐吾位于该属基部位置（图4）。

图4 12种植物质体基因组基于最大简约法构建系统发育树

Figure4 Phylogenetic tree constructed based on MP method for plasmids genomes of 12 species

3 讨论

经分析，黄帚橐吾质体基因组为典型的四段式环状DNA分子，四个区段的长度与橐吾属其他植物接近，并且四区段的边界无明显的扩张或收缩；该质体基因组的功能基因有134个，包括8个rRNA基因、37个tRNA基因和89个蛋白编码基因，与8种橐吾属植物的质体基因组构成一致^[28]，表明黄帚橐吾乃至橐吾属的质体基因组高度保守。

目前高等植物密码子使用偏性的研究主要集中于核基因，而叶绿体密码子的偏性亦具很大潜力，并且该类研究在近年来逐渐成为热点。黄帚橐吾叶绿体基因组密码子使用偏好性RSCU值>1的密码子有30个，其中以A/U碱基结尾的有27个；RSCU值<1的密码子有32个，其中以G/C碱基结尾的有29个；色氨酸（Trp）的RSCU值为1，无密码子偏向性。植物的叶绿体基因组中存在一个普遍的进化现象，即4个IR边界发生扩张与收缩事件使相同植物群体或不同植物群体的整个叶绿体基因组大小出现差异或较大差异。在叶绿体基因组的4个区域中IR区是高度保守的，此9个物种的IR区域的大小从151118bp至151253bp。在LSC/IRb边界区域，这9个物种都有4个基因位于边界区。本研究可以为黄帚橐吾的叶绿体基因表达载体的设计提供依据，从而调控相应基因的表达量^[29]。

黄帚橐吾质体基因组共含有37个散在重复序列，只包括18个正向重复序列和19个回文重复序列两种类型。散在重复序列在真核生物基因组中通常以多个拷贝出现，是其重要组成部分，对研究染色体重排以及基因组级的生物演化研究具有重要意义^[30-32]。黄帚橐吾的质体基因上共检测得到42个SSR位点，SSRs往往具有高度多态性，可进一步开发作为分子标记用于溯源鉴定和群体遗传学等研究^[33]。最大简约法系统发育树显示橐吾属聚为一支，黄帚橐吾位于该属基部位置，表明黄帚橐吾可能是该属中比较古老的类群。

（致谢：感谢青海民族大学生态环境与资源学院王久利博士在数据分析等方面给予的指导。）

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Plastome of Ligularia Virgaurea, an Indicator Species of Alpine MeadowDegradation

Li Xiaojuan^1,2,Qin Liying¹,Han Long¹,He Baoping¹,Deng Yinzi¹,Yang Xinguang^1,2（1.College of Ecological Environment and Resources,Qinghai Minzu University,Xining,Qinghai810007,China;2.Qinghai Provincial Key Laboratory of High-value Utilization of Characteristic Economic Plants,Xining,Qinghai810007,China）

Abstract:Ligularia virgaurea is a poisonous weed widely distributed in alpine meadow ecosystem of Qinghai-Tibet Plateau. Under the disturbance of overgrazing, the adaptive role of L.virgaurea through functional traits is stillunclear.In this study,Characterization of plastome of L.virgaurea were analyzed and the phylogenetic genomic analysis was conducted. The results showed that:(1)A total of 134 functional genes were annotated,including 8 rRNA genes,37 tRNA genes and 89 protein coding genes.(2)In the chloroplast genome of L.virgaurea, 30 codons with RSCU value>1 were found,and 27 condons with A/U base ending;32 condons with RSCU value<1,and 29 condons ending in G/C.Codons of the chloroplast genome of L.virgaurea was more inclined to end in G/C base.(3)A total of 37 scattered repeats, including 18 forward repeats and 19 palindromic repeats were detected in the chloroplast genome of L.virgaurea, and 42 SSR loci were detected.(4)Phylogenetic trees were constructed from the plastid genomes of 12 species of L.virgaurea and its allies by the method of maximum parsification(MP).The results showed that L.virgaurea might be an old species in genus Ligularia.This study provides a theoretical basis for environmental adaptability analysis, and learns more about the genetic background and germplasm identification of L.virgaurea at the molecular level.

Key words:Ligularia virgaurea;plastome;indicator species;phylogenetic analysis

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