31味中药和藏药水提物α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性研究

蒋思绒^1,2,3，王路雅^1,2,3，董琦^1,2,3，赵晓辉¹，江磊¹，刘增根¹，岳会兰¹*

（1.中国科学院西北高原生物研究所 中国科学院藏药研究重点实验室，青海，西宁，810008；

2.中国科学院西北高原生物研究所 青海省藏药研究重点实验室，青海，西宁，810008；3.中国科学院大学，北京，100049）

摘要：以阿卡波糖为阳性对照，对31种中药和藏药材水提取物进行了α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶（酵母菌），蔗糖酶和麦芽糖酶抑制活性筛选。研究发现，地骨皮和桑白皮水提物与市售药物伏格列波糖和米格列醇的酶抑制类型相同，对麦芽糖酶和蔗糖酶均具有较强抑制作用。南五味子和大花红景天与阿卡波糖的酶抑制类型相同，对淀粉酶和蔗糖酶具有较强的抑制作用。首次发现了白檀水提物对α-淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶均具有很强的抑制活性，绿萝花、当归、细叶小檗、南五味子、大花红景天、细果角茴香、诃子、白檀和唐古特白刺9种药材提取物具有很强的蔗糖酶抑制活性。本研究为上述几种中药和藏药材资源的进一步深入研究和开发利用提供了数据支持和科学依据。

关键词：餐后血糖，α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，蔗糖酶，麦芽糖酶，中药和藏药

中图分类号：R284.2 文献标识码： A文章编号：1005-9393(2021)03-0041-06

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由遗传和环境因素相互作用而引起的以持续高血糖为特征的慢性代谢性疾病，已成为影响全球居民健康的主要慢性非传染性疾病之一，其患病率呈逐年上升趋势^[1]。据国际糖尿病联盟统计，目前全球有4.25亿人患有糖尿病，到2045年，这一数字预计将达到近7亿。持续高血糖是糖尿病的主要表现，随着病程的持续导致严重的糖尿病并发症，包括冠状动脉疾病，中风，外周动脉疾病，视网膜病变，肾病和神经病变^[2]。现代药理研究表明，几乎所有Ⅱ型糖尿病都要经过葡萄糖耐量缺损（impaired glucose tolerance，IGT）阶段，IGT的主要临床特征表现为餐后高血糖。研究认为餐后高血糖是引起糖尿病人大血管并发症和微血管并发症的重要因素，而这些并发症是引起糖尿病死亡率增大的一个主要原因^[3]。抑制人淀粉酶以及人小肠α-葡萄糖苷酶的活性，将餐后血糖水平保持接近正常范围，是控制血糖波动，治疗和预防糖尿病及其并发症的重要方法^[4-7]。

目前，国内DM药物市场中应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类型的药物主要有阿卡波糖，伏格列波糖和米格列醇，这些药物能够通过抑制体内糖苷酶的活性，减少淀粉和寡糖的降解，减少葡萄糖的产生以及延缓葡萄糖的吸收入血从而实现其降低餐后高血糖的药效活性。阿卡波糖主要通过抑制淀粉酶及蔗糖酶的活性，抑制淀粉和蔗糖的分解起到降糖作用的。米格列醇和伏格列波糖主要是通过抑制蔗糖酶及麦芽糖苷酶的活性，减少蔗糖和麦芽糖的进一步的水解来起到降糖作用^[8-9]。但是他们的价格较贵，对于多数长期服药的糖尿病患者来说经济压力较大，并且伴有腹泻，腹部绞痛，胀气和呕吐等副作用。从天然植物资源中寻找和发现具有抑制α-葡糖苷酶活性的天然成分及其潜在的成药化合物，并开发成安全、高效的降血糖天然药物具有重要学术价值和社会意义。

中国传统医学的消渴症始见于《黄帝内经·奇病论》，名为消渴。中医所论消渴，肺热伤津、口渴多饮为上消；胃火炙盛、消谷善饥为中消；肾不摄水、小便频数为下消。肺燥、胃热、肾虚并见，或有侧重，而成消渴，缺一而不能成此症。本研究根据藏药志记载从中选取具有治疗止渴、脾虚、肾虚或是肺热功能的中药和藏药材，对其水提物进行α-淀粉酶，麦芽糖酶和蔗糖酶抑制活性研究，以期发现潜在α-葡糖苷酶抑制剂天然产物来源^[10]。

1材料

  1.1实验动物：

SD大鼠，雄性，6周龄，体质量 (200±15）g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，合格证号为SCXK（陕）2017-003。

  1.2药品及试剂：

31味中药和藏药材（详见表1），均购自青海中药和藏药市场；麦芽糖、蔗糖和阿卡波糖，Solaibio公司；猪胰腺α-淀粉酶，爱尔兰Megazyme公司；葡萄糖，上海麦克林生化科技有限公司，淀粉，广州天骏生物科技有限公司。

  1.3仪器：

H1850R低温离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），Epoch2酶标仪（BioTek公司），BE9010恒温振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），CTXNW-100B循环超声提取机（北京弘祥隆生物技术开发有限公司），N-1210BV-WB旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），天平（奥豪斯仪器有限公司），FDU-1100冷冻干燥机（埃朗科技国际（上海）有限公司），PTA-125纯水仪（成都沛斯特科技有限公司）。

2方法

  2.1中药和藏药材醇提物制备

31中药和藏药种药材各取2 g加入10 mL纯净水室温浸泡30min，加热超声提取2次共2h，合并2次提取液浓缩冷冻干燥得到提取物。具体中药和藏药名称和拉丁名表1。

表1  中药和藏药名称和拉丁名

  2.2 α-淀粉酶抑制活性筛选

参照文献的方法^[12]，在冰浴的条件下，在96孔板里加入50µL 5mg·mL-1的样品和50µL 10U·mL^-1的酶液，放入37 ℃恒温振荡器，100 r· min^-1孵育10min，再在冰浴的条件下加入50µL 0.1%（w/v）的淀粉，然后放入37℃恒温振荡器，100r·min^-1孵育20min，立即投入冰水浴5 min，降低酶活性，继续加入100µL DNS溶液，100 ℃下反应5 min。降至常温后在540 nm的波长下检测，并计算样品对酶的抑制活性。

  2.3大鼠小肠糖苷酶的提取及活力测定

参照文献的方法，大鼠禁食12小时的，脱颈椎处死，立即取出小肠置冰台上，剖开小肠并翻转暴露肠粘膜，用4℃预冷的PBS冲洗后拭干，用玻片刮取小肠粘膜，按质量体积比1：5加入4℃预冷的PBS，匀浆，4℃ 8000 r·min^-1离心20min，取上清液分装，-20℃贮备备用。取上清酶液0.1mL加0.35mL PBS，37℃水浴10min，加入0.25 mol·L^-1蔗糖（麦芽糖）溶液50 μL，20 min后立即投入冰水浴中5 min，继续加入Na₂CO₃溶液0.5 mL终止反应。3孔平行测定，将37 ℃、PH 6.8条件下，1L溶液中每分钟生成1 μmoL葡萄糖定义为1个酶活力单位。酶活力＝葡萄糖浓度×2×1000/20。

  2.4蔗糖酶抑制活性筛选

参照文献的方法^[11]，将50 μL含有17.5 U·mL^-1的酶液和50 μL 5 mg·mL^-1样品加入48孔板，在37 ℃下预孵育10 min。然后加入50 μL 0.5 mol·L^-1蔗糖溶液，将该混合物在37 ℃下孵育20 min。立即投入冰水浴5 min，降低酶活性，继续加入0.1 mol·L^-1 Na₂CO₃溶液50 µL终止反应。采用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖浓度，并计算样品对蔗糖酶的抑制活性。

  2.5麦芽糖酶抑制活性筛选

参照文献的方法^[11]，将50 μL含有11.56 U·mL^-1的酶液和50 μL 5 mg·mL^-1样品加入48孔板，在37℃下预孵育10 min。然后，加入50 μL 1.39 mmol·mL^-1麦芽糖溶液，将该混合物在37 ℃下孵育20 min。立即投入冰水浴5 min，降低酶活性，继续加入0.1 mol·L^-1 Na₂CO₃溶液50 µL终止反应。采用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖浓度，并计算样品对麦芽糖酶的抑制活性。

3结果

  3.1 31种药材水提物对α-淀粉酶活性的影响

通过对31种药材水提取液的α-淀粉酶抑制活力的比较，发现党参、细叶小檗、辽五味子、南五味子、大花红景天、葫芦巴、姜黄、菥蓂、白檀和冰川茶藨子10种药材水提物的抑制活力较高，抑制率均在50%以上，其中，辽五味子、南五味子、大花红景天、葫芦巴、白檀和冰川茶藨子水提取液对α-淀粉酶抑制率达到了80%以上。其它19种药材水提物对酶的抑制活性均在50%以下。结果见图1。

图1  31味药材水提取液体外对α-淀粉酶活性的影响

研究不同浓度下辽五味子、南五味子、大花红景天、葫芦巴、白檀和冰川茶藨子水提取液对α-淀粉酶抑制活性，并计算其IC₅₀。实验结果显示，辽五味子、大花红景天和白檀3种药材的水提物对α-淀粉酶的抑制活性强于其它三种药材提取液，其IC₅₀值分别为0.365 mg·mL^-1, 0.037 mg·mL^-1和0.228 mg·mL^-1。阳性药阿卡波糖IC₅₀值为0.003 mg·mL^-1。与阳性药比较发现，大花红景天水提液α-淀粉酶抑制活性与阳性药阿卡波糖相当。

图2  不同浓度下阿卡波糖和6种药材水提物淀粉酶抑制活性IC50值

  3.2 31种药材水提物对麦芽糖酶活性的影响

31种药材水提物对麦芽糖酶抑制活力结果显示，地骨皮、细叶小檗、桑白皮、菥蓂、细果角茴香、野党参、诃子和白檀8种药材水提液抑制活力较高，抑制率均在50%以上。其中，地骨皮、桑白皮和白檀水提物对麦芽糖酶抑制率达到了80%以上。其它23种药材水提物对麦芽糖酶的抑制活性均在50%以下。见图5。

图3  31种药材水提物对麦芽糖酶活性的影响

对以上3种酶抑制活性最强的药材提取物进行IC50值的测定，结果显示，地骨皮、桑白皮和白檀水提物IC₅₀值分别为4.549 mg·mL^-1，0.019 mg·mL^-1和0.910 mg·mL^-1。而阳性药阿卡波糖IC₅₀值为0.002 mg·mL^-1。对比结果显示，桑白皮和白檀相对与地骨皮具有更强的麦芽糖酶抑制活性。

图4  不同浓度下阿卡波糖和3种药材水提物麦芽糖酶抑制活性IC₅₀值

  3.3 31种药材水提物对蔗糖酶活性的影响

通过对31种药材水提取物的蔗糖酶抑制活力检测结果发现，地骨皮、当归、细叶小檗、桑白皮、诃子、白檀和唐古特白刺12种药材的抑制活力较高，抑制率均在60%以上。其中，地骨皮、绿萝花、当归、细叶小檗、南五味子、大花红景天、桑白皮、细果角茴香、诃子、白檀和唐古特白刺水提取液对麦芽糖酶抑制率达到了80%以上，而其他20种药材水提物对酶的抑制活性均在60%以下。见图5。

图5  31种药材水提物对蔗糖酶活性的影响

对以上7种酶抑制活性最强的药材提取物进行IC₅₀值的测定，结果显示，其IC₅₀值分别为5.512 mg·mL^-1，5.597 mg·mL^-1，9.111 mg·mL^-1，3.975 mg·mL^-1，1.745 mg·mL^-1，1.184 mg·mL^-1和2.606 mg·mL^-1。提取物的酶抑制活明显弱于阳性药阿卡波糖，其IC₅₀值为达到0.014 µg·mL^-1。见图6。

图6  不同浓度下阿卡波糖和7种药材水提物蔗糖酶抑制活IC₅₀值

4 讨论

α-葡萄糖苷酶是一种水解酶，主要分布在小肠上皮绒毛膜刷状缘上，主要是负责催化多糖和二糖水解生成葡萄糖。α-葡萄糖苷酶抑制剂能够抑制小肠上皮细胞中α-葡萄糖苷酶的活性，有效的减缓葡萄糖的产生和吸收，从而可以有效地调控餐后血糖浓度，使血液中的血糖浓度保持在正常水平。α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物对于I和II型糖尿病都有明显的控制血糖的作用。目前用于临床的药物主要有：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。阿卡波糖主要通过抑制淀粉酶及蔗糖酶的活性，抑制淀粉和蔗糖的分解，从而起到降糖作用。米格列醇和伏格列波糖主要是通过抑制蔗糖酶及麦芽糖酶的活性，减少蔗糖和麦芽糖的进一步的水解来起到降糖作用^[8-9]。

目前报道的天然产物α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选和研究大多以p-NPG作为底物，以市售酵母菌来源α-葡萄糖苷酶为反应酶^[13-14]，以淀粉、麦芽糖、蔗糖为底物进行酶抑制活性研究。而以动物为来源的淀粉酶和糖苷酶为反应酶的研究报道较少^[12]。我们前期研究发现，唐古特大黄中单体化合物白藜芦醇苷的α-葡萄糖苷酶（酵母菌来源）抑制活性远远强于阳性药阿卡波糖，其IC₅₀值是阳性药阿卡波糖的1/10，但是进一步体内活性研究发现在同等剂量下白藜芦醇苷活性远不及阿卡波糖^[14]。Zhang等报道，以猪胰来源淀粉酶和大鼠小肠来源糖苷酶为反应酶，以淀粉，麦芽糖和蔗糖为反应底物对不同类型的天然产物进行筛选，在此基础上进行体内降血糖活性研究，发现体外筛选结果与体内验证结果基本一致^[11]。为了更加全面的反应中药和藏药提取物体外糖苷酶抑制活性，本研究同时采用上述几种筛选模型进行α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外筛选。

本实验根据藏药志记载从中选取具有治疗止渴、脾虚、肾虚或是肺热功能的中药和藏药材，对其水提物进行α-淀粉酶，麦芽糖酶和蔗糖酶抑制活性研究。研究发现：辽五味子、南五味子、大花红景天、葫芦巴、白檀和冰川茶藨子水提取液对α-淀粉酶具有很强的抑制作用，其中大花红景天水提物α-淀粉酶抑制活性与阳性药阿卡波糖相近；地骨皮、桑白皮和白檀这3种药材的水提物对麦芽糖酶均具有较强的抑制作用，其中桑白皮和白檀相对与地骨皮具有更强的麦芽糖酶抑制活性；另外，筛选出地骨皮、绿萝花、当归、细叶小檗、南五味子、大花红景天、桑白皮、细果角茴香、诃子、白檀和唐古特白刺11种药材的水提物对蔗糖酶具有较强的抑制作用。首次发现白檀水提物具有很好的糖苷酶抑制活性，该提取物对α-淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶均具有很强的抑制活性。地骨皮和桑白皮水提物与市售药物伏格列波糖和米格列醇的酶抑制类型相同，对麦芽糖酶和蔗糖酶均具有较强抑制作用。南五味子和大花红景天与阿卡波糖的酶抑制类型相同，对淀粉酶和蔗糖酶具有较强的抑制作用。首次发现了绿萝花、当归、细叶小檗、南五味子、大花红景天、细果角茴香、诃子、白檀和唐古特白刺9种药材提取物具有很强的蔗糖酶抑制活性。本实验对31种中药和藏药材进行了在体外糖苷酶抑制活性研究，对筛选出的具有酶抑制活性的药材提取物有待进一步体内活性验证。另外，具有活性的药材提取物中的活性成分也有待进一步的分离提取和分析研究。

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基金项目:国家自然科学基金项目（31701243）；青海省重点研发与转化计划项目（2019-SF-122）；青海省藏药研究重点实验室（2021-ZJ-Y03）。

作者简介:蒋思绒，硕士研究生，主要从事青藏高原特色药用植物资源化学成分及药理活性研究。

通信作者:岳会兰，副研究员，硕士生导师，主要从事青藏高原特色药用植物资源化学成分及药理活性研究。

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